兽医寄生虫疫苗研究现状与展望

随着寄生虫学者对寄生虫形态、结构等特征的研究,寄生虫免疫学开始揭晓。目前使用的寄生虫疫苗主要是活苗或致弱苗,属劳动密集性产品,主要集中于原虫,包括球虫、弓形虫、新孢子虫、巴贝斯虫、梨形虫和贾第虫等,而针对线虫、绦虫和体外寄生虫的疫苗相对较少。
寄生虫疫苗不像细菌与病毒苗那样容易研制成功,主要是因为寄生虫是真核生物,大多数是多细胞动物,有着复杂的生活史,虽然在寄生虫的离体培养上取得了一定的成就,但是绝大多数寄生虫还不能在人工条件下离开宿主培养;寄生虫抗原复杂、易变异、伪装、表面抗原脱落与更新,使宿主难以产生保护性免疫应答。
现分别将已成功研制和正在研制的疫苗的研究进展及应用情况介绍如下。

寄生虫病是严重危害养殖业的重要疾病。在长期的生产实践中,寄生虫病主要靠化学药物进行防控。随着使用时间的延长,许多寄生虫已经产生抗药性,如球虫、锥虫、巴贝斯虫、疟原虫、捻转血矛线虫、古柏线虫、铜绿蝇等,使得传统的化学药物防治方法受到了严重挑战。随着公众对公共卫生关注程度的提高以及人们对绿色食品的需求不断扩大,药物残留与药物污染问题也成为限制药物使用和开发的重要因素。因此,通过注射疫苗来防控寄生虫病,始终是人们追求的目标。在过去的几十年中,随着科学技术的不断进步和对寄生生物学认识的不断深入,兽医寄生虫疫苗研究取得了重大进展,并出现了新的研究趋势。本文将就有关情况进行简单介绍。

一、已研制成功的疫苗 致弱苗
从目前使用的兽医寄生虫疫苗类型来看,致弱活疫苗占有绝对优势,其保护机理主要是模仿自然感染,刺激机体产生免疫应答。但活疫苗也存在不少问题:
安全性问题:活苗虽然可以产生一定的免疫保护,但毕竟是活的虫体,在特定的情况下,仍有致病的可能;
免疫保护效果不一:有些寄生虫可以感染多种动物,其疫苗往往对某种动物保护效果较好,对另种动物保护效果较差,或者对不同年龄的动物保护效果不一致;
经济效益:尽管有些疫苗免疫保护性好,但生产成本高、免疫方法复杂、与抗寄生虫药的广谱性相比具有较窄的保护范围。
正是由于上述问题的存在,在一定程度上制约了致弱寄生虫疫苗的使用,同时,也促使相关人员去研究和开发新的疫苗。
分泌抗原苗
寄生虫的分泌或代谢产物具有很强的抗原性。制备分泌抗原苗的一种途径就是在具备成功的培养技术的前提下,可以从培养液中提取有效抗原作为制备虫苗的成分。这方面最成功的例子有牛的巴贝斯虫苗和犬的巴贝斯虫苗,分别在澳大利亚和欧州广泛应用。这种虫苗实际上是一种混合苗,它包括多种成分,在应用时往往需要佐剂和多次接种,而且其前期技术条件要求较高,并需要一定的资金投入,成本上有时不易被接受。制备分泌抗原苗的另一个途径是从发病动物体内直接提取抗原。例如从发病泰勒虫病牛血清中提取的抗原可以再免疫其它易感牛。
基因工程疫苗
在抗寄生虫感染方面,已对DNA疫苗研究展开了积极的探索。在日本,分体吸虫、绦虫、疟原虫、利什曼原虫、隐孢子虫、弓形虫、锥虫、球虫等疾病中,DNA疫苗研究已经取得了较好的进展,其中疟疾DNA疫苗已获准生产。
重组基因工程苗在寄生虫方面成功的例子为血吸虫重组基因工程苗,以重组GST为代表的基因工程苗在动物和人体上都进行了试验,保护效果在50%以上。该蛋白质在血吸虫的各个发育时期都有表达。另外,该抗原还可在大肠杆菌内高效表达,且提纯方法极为简单。

一、兽医寄生虫疫苗研究现状

二、正在研制的疫苗 疟原虫疫苗
疟疾疫苗的研制是疟疾防治中的重要内容。从70年代的全虫活疫苗,到80年代的基因工程亚单位疫苗和化学合成多肽疫苗(如SPF66),由于其激发的免疫反应低下、临床试验效果不佳,没有得到广泛的应用。
90年代核酸疫苗以其突出的优点,引起了研究人员的极大兴趣,Sedegah等用约氏疟原虫环子孢子蛋白基因真核表达质粒肌肉注射小鼠后,可产生抗环子孢子蛋白特异性抗体和CTL反应,两种反应的水平均高于减毒子孢子免疫的小鼠。接种DNA疫苗的肝期原虫用5×105子孢子攻击,可使感染负荷下降86%;接种2~3次DNA疫苗的小鼠,再以102子孢子攻击,结果显示疫苗对68%的小鼠具有保护作用,说明接种核酸疫苗可用于抗疟疾感染。
目前,用作疟原虫核酸疫苗研究的保护性抗原基因主要有:CSP、MSA1、MSA2、SSP2、HEP17、EXP1和RESA等。1997年Butler等在Nature上报道了一项临床试验,以一种编号QS21的试剂为佐剂,接种含环子孢子疟原虫蛋白基因的核酸疫苗,结果7个志愿者经感染有疟原虫的蚊子的反复叮咬后有6人获得了保护。该项试验为寄生虫核酸疫苗应用于人体提供了宝贵的经验。
利什曼原虫疫苗 利什曼原虫不同种及亚种引起不同类型的利什曼病,
分别具有不同的流行病学特征。利什曼病疫苗可分为组分抗原、经遗传手段转化的无毒活虫株、合成和重组抗原、表达利什曼抗原的重组菌/病毒和DNA
疫苗, 大多数均处于临床前期。
在分子疫苗候选抗原研究方面也取得了重大进展,如表面糖蛋白GP63、Lack抗原和虫体表面抗原2。其中GP63已进行了广泛而深入的研究,
该糖蛋白是迄今为止研究最深入的一种细胞外酶,
又称主要表面抗原或前鞭毛体表面蛋白酶,约占前鞭毛体总蛋白量的1%。
这些抗原加佐剂免疫可在试验动物诱导明显保护性,但这些佐剂可能不适合应用于人;已找到其他途径用感染载体如BCG,沙门氏菌和豆苗病毒构建重组BCG表达的利氏曼表面抗原GP63,并证明可诱导小鼠对利氏曼原虫的保护性免疫力。编码GP63基因还在致弱鼠伤寒沙门氏杆菌表达,并用口服途径免疫小鼠。Xu等用含编码利什曼原虫GP63基因核酸疫苗pcDNA1-GP63直接免疫BALB/c鼠,检测到质粒在小鼠至少存在40天,抗体免疫组化染色显示高水平表达的GP63。硕大利什曼原虫攻击感染,发现鼠已产生高度抵抗力。利什曼原虫抗原能诱导免疫小鼠产生高水平细胞因子,通过Th1型细胞免疫抵抗攻击。BALB/c小鼠一般对利什曼原虫感染敏感,因为它不能激活Th1反应,除非加入外源性的IL-12。刘全等还证明Lack抗原基因也能诱导小鼠产生对利什曼原虫产生保护性免疫。
胃肠道线虫疫苗
血矛线虫、食道口线虫及仰口线虫是牛、羊分布最广、危害最大的一类消化道线虫病,目前主要采用芬苯哒唑和阿维菌素类药物治疗,疫苗研究也较多且有成功的报道。Munn等发现用存在于线虫肠道微绒毛表面的contorton蛋白免疫羊后,可使捻转血矛线虫感染下降78%。从此,肠道相关抗原的研究就成了吸血线虫及其他吸血寄生虫的研究热点。
H11是110kDa的膜内在蛋白,具有氨肤酶A及M
活性,与消化血液有关,与抗体结合后,可破坏III期以上虫体的消化功能,保护率与抗体滴度呈正相关,但在自然感染情况下无免疫原性,有可能属于隐蔽抗原。H11疫苗的免疫效果相当令人满意,免疫羊保护率可达90%以上,保护期达23周以上,且不影响自然免疫,母体还可通过胎盘将抗体传给胎儿。捻转血矛线虫的其他肠道相关抗原也可诱导羊产生高水平的免疫保护,如H-gal-GP和TBSP,目前,国外在重组H
l l 、H-gal-GP及TBSP疫苗方面的进展很快。
但上述所有分子的抗原表位都含有复合糖的组分,很难在常规表达载体中正确表达,故Redmond等开始用于体外繁殖且能自由生活的线虫,如Caenorhabditisele,gans,进行这些抗原的体外表达,已获得可喜进展。
血吸虫苗 在血吸虫方面,已发现多个有一定免疫保护作用的抗原,如副肌球蛋白
, GST, FABP、膜蛋白、抗凋亡因子等。
Yang和Waine等分别通过对小鼠肌肉注射携带编码日本血吸虫副肌球蛋白、26和28
KDa谷胱甘肽-S-转移酶、钙网硬蛋白、磷酸丙糖脱氢酶、22.6 KDa膜蛋白、14
KDa脂肪酸结合蛋白基因质粒DNA(该6种蛋白分子为目前公认有希望的血吸虫疫苗候选分子),但仅仅副肌球蛋白核酸疫苗诱导了鼠特异性抗体的产生。而Kayes等用曼氏血吸虫28
KDaGST核酸疫苗免疫小鼠,在血清中测有特异性抗GST
IgG抗体。国内李传明等的实验结果也表明,日本血吸虫26 KDa
GST-DNA疫苗免疫小鼠后能诱生一定水平的抗血吸虫抗体,免疫鼠可形成一定的预防血吸虫尾蚴感染的保护性免疫力;同时可减轻宿主肝组织血吸虫卵所致的病理损害作用。
囊尾蚴及棘球蚴苗
囊尾蚴病和棘球蚴病是发展中国家主要的人畜共患病,危害非常严重,可喜的是囊尾蚴及棘球蚴重组疫苗的研究均相当成功。棘球蚴苗EG95可诱导牛产生96%~100%的保护率,这已在澳大利亚、新西兰、阿根廷及中国等地的试验中获得证实。羊带绦虫苗45w可诱导羊产生92%以上的保护率,对牛的无钩绦虫也有较高的保护率。EG95,45w及羊带绦虫中含类似结构的其他抗原To18及To16均是在大肠杆菌中诱导表达的,具有种间交叉保护作用。如羊带绦虫的45w
, To
18及To16抗原混合后可诱导猪对有钩绦虫的攻击感染产生保护。另一些抗原,如六钩坳的FABP,亦可作为疫苗后选抗原。Chabalgoity等以减毒沙门氏菌为受体菌,表达了该抗原,经口免疫犬后,发现可诱导相应的体液及细胞免疫反应。
李文桂等用多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/c鼠,免疫8周后用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染,观察小鼠脾细胞因子的变化,结果显示多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠产生一个Th1型反应,从而对抗Em原头节攻击感染。
小隐孢子虫疫苗 何宏轩等将编码C.parvum子孢子15KD
CP15表面蛋白基因插入真核表达载体pCR3.1中构建重组质粒pCR3.1-15,然后经鼻黏膜免疫怀孕成年山羊,发现抗CP15抗体存在于免疫山羊的血浆和初乳中。pCR3.1-15经鼻腔免疫的怀孕山羊产生的免疫力能传给子代,使子代对C.parvum感染产生保护。他们进一步用含有C.parvum表面蛋白CP15/60基因的重组质粒pcDNA3-15/60经鼻黏膜免疫接种BALB/c小鼠,再使其经口接种微小隐孢子虫卵囊。发现该质粒能诱导机体产生系统和粘膜免疫应答。
弓形虫核酸疫苗 M ev elec 等研究发现用分别表达弓形虫两种抗原SAG1 和GRA4
的质粒免疫C57BL/6
小鼠。经攻毒保护试验发现,小鼠可获得62%的存活率。而用联合表达的质粒免疫后则获得75%的存活率。若在联合免疫的同时再注入表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,则可获得87%的存活率。韩广东等用携带了弓形虫POP2
基因的质粒DNA
免疫小鼠,发现该疫苗能使小鼠产生强烈的细胞、体液反应,并延长小鼠的存活时间,推迟了开始死亡的时间。弓形虫病核酸疫苗的候选基因有:表面膜蛋白P30基因、P22
基因;棒状体蛋白基因ROP1 基因、R0P2 基因;致密颗粒抗原体外寄生虫疫苗
蝇、虱、螨、蜱等体外寄生虫严重危害着牛、羊的健康,在预防这些寄生虫的疫苗中,用于预防牛的微小牛蜱的疫苗,即澳大利亚Biotech及CSIRO研制的大肠杆菌表达的微小牛蜱基因工程苗,商品名为TickGard,现Biotec公司生产了第二代微小牛蜱苗–Tick-Gard
Plus,免疫效果更强,目前已在加拿大获准生产。与此类似的是用古巴酵母Pichia
pastorale,表达的Gavac苗,并由HeberBiotec公司生产,一种针对牛纹皮蝇的蛋白酶的重组疫苗在实验中也获得成功,已被批准由加拿大的Alberta作为商品疫苗销售。除以上三种疫苗外,其他体外寄生虫,如旋皮蝇、蛙虱、东方血蝇等疫苗也正处于研制之中。
三、展望
随着各学科的迅速发展和相互之间的渗透,尤其是现代生物技术发展的日新月异,为寄生虫病免疫学研究提供了强有力的工具。怎样快速高效地发现保护性抗原或表位,一直是抗寄生虫分子疫苗研究的热点课题,基于寄生虫本身及其与宿主相互作用的生物学和免疫学特征,通过实验技术鉴定疫苗候选分子始终是最根本的方法。
但随着寄生虫功能基因组学的发展,积累了大量的可进一步挖掘利用的分子序列资料。因此,近年发展的反向疫苗学方法,即先对这些序列进行免疫信息学理论预测分析,然后结合实验鉴定获得疫苗候选分子或表位,可望加快寄生虫分子疫苗的研发进程。
目前,已有一些理论预测结合实验鉴定寄生虫Th细胞表位的工作,除个别研究小组对恶性疟原虫(Plasmodium
falciparum)保护性表位筛选整体策略上采用的反向疫苗学方案外,基本上是对已知的候选疫苗分子进行Th细胞表位的绘制,都为理论预测结合实验鉴定技术发现保护性抗原表位积累了基础资料。如果能合理地利用它们,使之更好的为寄生虫疫苗研发服务,将成为今后广大科研工作者的研究热点和重点。
参考文献略
作者:王军,男,助理兽医师,大学本科,主要从事动物疫病的诊断与防治工作。E-mail:wjrz520@sina.com
TEL:13909987069 0998-6186379

(一)已商品化的兽医寄生虫疫苗(见表1)
目前商品化/工厂化生产/政府组织公布的寄生虫疫苗,主要集中于原虫,包括球虫、弓形虫、新孢子虫、巴贝斯虫、梨形虫和贾第虫,而线虫、绦虫和体外寄生虫疫苗还很少。

(二)兽医寄生虫疫苗的获得手段
从目前使用的兽医寄生虫疫苗类型来看,致弱活疫苗占有绝对优势,其保护机理主要是模仿自然感染,刺激机体产生免疫应答。主要采取以下几种途径筛选:(1)通过特殊动物传代或在体外培养使毒力降低,如牛巴贝斯致弱苗就是通过在切除脾脏牛体内反复传代获得的。(2)筛选缺少某一生活阶段的虫株,如刚地弓形虫S48株就不能形成包囊。(3)筛选生活周期缩短的虫株,如早熟艾美尔球虫苗。(4)辐射致弱。

(三)兽医寄生虫疫苗存在的问题
虽然目前已经有若干寄生虫疫苗上市或在局部地区应用,但使用并不广泛。影响寄生虫疫苗推广和应用的主要因素有:(1)安全性问题。目前的寄生虫疫苗主要为活苗,虽然可以产生一定的免疫保护,但毕竟是活的虫体,在特定的情况下,仍有致病的可能。(2)免疫保护效果。有些寄生虫可以感染多种动物,其疫苗往往对某种动物保护效果较好,对另种动物效果较差,或者对不同年龄的动物保护效果不一致。(3)经济效益。尽管有些疫苗免疫保护性好,但生产成本高、免疫方法复杂、与抗寄生虫药的广谱性相比具有较窄的保护范围均限制了疫苗在生产中的应用。正是由于上述问题的存在,在一定程度上制约了寄生虫疫苗的使用,同时,促使人们去研究和开发新的疫苗。

二、兽医寄生虫疫苗展望

(一) DNA疫苗 DNA疫苗是近几年发展起来的一种新型疫苗。因其操作简便,
既具有重组亚单位疫苗的安全性,又具有减毒活疫苗高效、持续诱导全方位免疫应答的优点,该疫苗问世以来,引起了全世界的研究热潮,科学家们纷纷将这种免疫接种手段应用于感染性疾病及肿瘤的防治研究中,1995年4月被美国纽约科学院称为疫苗学的新纪元。

澳门新葡亰平台游戏app,目前对DNA疫苗免疫机理的认识还仅仅是个开始,许多实验现象还不能用现有的理论进行解释。就最近的研究资料,可以将DNA疫苗的免疫机理概括为3个方面。(1)DNA疫苗在非淋巴系统的组织细胞,如肌细胞内表达抗原,再被分泌或被损伤的细胞释放到组织间隙,最终被抗原提呈细胞捕获、加工、提呈给T细胞,诱生免疫应答。(2)抗原提呈细胞直接摄取DNA疫苗,表达抗原并提呈给T细胞,触发免疫应答。以任何途径接种DNA疫苗,抗原提呈细胞都可能直接摄取质粒DNA,表达外源蛋白,以内源性抗原的加工、提呈方式诱导细胞和体液免疫应答,尤其能诱导强的细胞免疫应答。(3)质粒DNA
能刺激抗原提呈细胞分泌多种细胞因子,从而调节T、B细胞功能,发挥强大的免疫佐剂作用。有学者从功能上将DNA疫苗分为2个部分,即转录单位和佐剂单位。

在抗寄生虫感染方面,DNA疫苗研究已展开了积极的探索。在日本分体吸虫、绦虫、疟原虫、利什曼原虫、隐孢子虫、弓形虫、锥虫、球虫等疾病中,DNA疫苗研究中取得了较好的结果,其中疟疾DNA疫苗已获准生产。

(二)树突状细胞苗
树突状细胞(DC)是专职抗原提呈细胞(APC),广泛分布于全身各个组织器官。病原体感染机体后,不成熟DC经模式识别受体(如Toll
样受体,TLR)识别病原体抗原并成熟,虽吞噬活性下降,但细胞表面分子(如MHC-1、Ⅱ类分子)、共刺激分子(CD40、CD80
、CD86、CD54)、黏附分子以及细胞因子(IL-12、IL-10、IFN-α)表达增强,能有效地刺激初始性T细胞的增殖反应,因此在启动机体免疫应答中发挥重要作用。

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